优化条件包括:细胞培养条件,转染试剂的优化,三质粒比例的优化(1:1:1)等 3.慢病毒的浓缩与纯化(提高病毒滴度和纯度) 采用PEG8000方法浓缩病毒 (1)5× PEG8000 -NaCl配制:称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50 g溶解在200 mL纯水中;121 ℃ 30 min 湿热灭菌 ;保存在4℃; (2)每30ml过滤后的粗病毒液,加入5× ...
一、实验材料1. 慢病毒载体慢病毒载体:该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G, pLVX-CMV-EGFP-gene或者pLKO-U6-shRNA-EGFP-puro。其中pspax2, pMD2G是辅助质粒,另一个是骨架载体,骨架载体上的EGFP能表达绿色荧光蛋白(GFP),过表达的基因以及敲低序列shRNA均构建在慢病毒骨架载体上;2. 细胞...
三质粒的转染体系三种质粒的配比有许多种方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2:PMD2g:PLVX(载有你基因的质粒)。10cm dish一般转染质粒的总质量为20μg,PEI的量为质粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推荐按照2.5倍来)。按照比例算下来,PxpAx...
3. 转染293细胞:分别在两个洁净的1.5ml离心管加入500ul无血清MEM(或DMEM、PBS、saline),其中一只管中混合包装病毒用四种质粒(CDHv或CDHv-Gene、RRE、VSVG和REV),各质粒用量依次比例为4ug:4ug:3ug:2ug(或为4ug: 4.2ug:3.2ug:2.1ug),轻轻吹打3-5次混匀;另一只管中加入PEI溶液,用量(ul数)与质粒量(ug...