PCR实时荧光定量分析 使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 从 GBS 的过夜培养物中提取基因组 DNA。PCR 反应最终体积为 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 无菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探针（100 μM 储备...
实时荧光定量PCR(realtime PCR)一、 样品RNA的抽提 1. 取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,...
荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），PCR阻断...
如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究,就需要采用实时荧光定量PCR,根据检测实时荧光PCR产物的方式不同,实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。 1.DNA结合染料法 原理:应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。
一、实时荧光PCR的基本原理 实时荧光PCR是一种高灵敏的PCR技术,它主要是利用荧光标记探针来检测模板的扩增过程,从而得出DNA片段扩增的数量和速度。实时荧光PCR通常利用5’和3’端有荧光活性的探针对模板DNA进行检测,以高精度确定模板DNA的数量和种类。 与传统PCR技术不同,实时荧光PCR技术可以实时跟踪和检测生物序列的复...
该法是最早用于定量的方法,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
一、实时荧光PCR基本原理 实时荧光PCR通过不同于传统PCR的仪器,可以检测每个循环结束后的产物量,从而实现PCR扩增的动力学监测。目前的实时荧光PCR均是基于荧光共振能量转移的原理,即FRET。也就是说,当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团距离临近一定范围时,就会发生荧光能量...
目前,实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,并结合相应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。 01 一、荧光染料法 在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,该染料只与双链DNA小沟结合,...
与待测基因同时进行相同的PCR扩增。 尽管在大多数情况下内参基因的表达非常稳定,但是其表达在某些情况下也会发生变化,并不是任何内参基因都适合任何实验。在选择内参基因时,应仔细考虑各种因素,选择合适的内参基因或内参基因组合。 基因表达变化倍数计算方法