基因敲入(Knock-in)是在目的基因位置引进特定的突变或外源基因,比如在目的基因引入点突变(模拟人类遗传疾病模型),或将报告基因(如EGFP、RFP、mCherry、YFP、LacZ、Luciferase等)或需要表达的功能性cDNA(如Cre、Dre等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点,从而使报告基因或其他cDNA的表达与目标基因的表达一...
CRISPR - Cas9 是一种源自细菌免疫系统的基因编辑技术。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌基因组中的一段特殊 DNA 序列，Cas9 是一种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶。在基因编辑过程中，通过引导 RNA（gRNA）将 Cas9 引导到目标 DNA 序列位置，然后 Cas9 对目标 DNA 进行切割。
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)是细菌基因组中的一段特殊 DNA 序列,Cas9 是一种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶。在基因编辑过程中,引导 RNA(gRNA)将 Cas9 引导至目标 DNA 序列位置,随后 Cas9 对目标 DNA 进行切割。 1.敲入(Knock - in)概念 基因敲入是一种将外源基因或经过修饰的基因序列精准插入基因组...
功能丧失，称之为基因敲除（Knock out，KO）；通过HDR修复DSB时，细胞修复系统会将额外提供的一个与靶DNA两侧同源的外源片段作为模板，在DSB处合成与同源序列互补的基因序列，由于外源片段中携带待敲入的突变或目的基因，因此就可以在基因组中精确地引入点突变，或者插入目的基因，称之为基因敲入（Knock in，KI）。
这种修复机制主要用于CRISPR/Cas9系统介导的Knock-in。在该修复路径中，将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中，即可实施对基因组的高精度编辑[1-3]。Cas9 介导同源重组（HDR）除了需要多引入一条修复模板，基本操作和基因敲除（KO）基本一致。顺利的...
5、同源臂的模板序列:左右同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增,避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源,降低HDR效率[10]。 Knock-in实验的成功,除了donor的选择,实验之前保证sgRNA的特异性,验证sgRNA的切割活性对于Knockin实验的成功也非常重要,这些设计方法与验证方法与前几期敲除中的方式一致,小伙伴...
CRISPR-Cas9基因敲入（knock-in）是一种常用的基因编辑技术，用于将特定的DNA序列插入到基因组的指定位置。以下是CRISPR-Cas9基因敲入系统的基本流程：1. 设计sgRNA（单导RNA）目标序列选择：选择靶基因的特定位点，确保附近有PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。设计sgRNA：根据靶基因的目标序列设计与其互补的sgRNA。
细胞基因定点敲入案例HEK293细胞基因定点敲入突变基因：FOXG1基因；KI片段大小：2.5 Kb Cas9-Cell line Knock-In service（Cas9-CKI）基因定点敲入细胞系是Cas9X技术团队针对实验室常用的各种细胞系，研究并确立针对不同的细胞的外源基因或者片段高效敲入（Knock-in, KI）的技术操作规程，主要目的就是：解决KI效率低...
5、同源臂的模板序列:左右同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增,避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源,降低HDR效率[10]。 Knock-in实验的成功,除了donor的选择,实验之前保证sgRNA的特异性,验证sgRNA的切割活性对于Knockin实验的成功也非常重要,这些设计方法与验证方法与前几期敲除中的方式一致,小伙伴...