1.基因敲除(Knockout):通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂(DSB),细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复断裂,过程中可能引入插入或缺失(indels)突变,导致目标基因功能丧失。 2.基因插入或替换(Knockin):利用同源重组(HDR)机制,在目标基因上引入特定的突变或外源序列。这需要提供一个含有所需改变的同源模板DN...
基因敲除(Knock out,KO):通过CRISPR-Cas9在目标基因上产生DSB,细胞通过NHEJ修复机制修复断裂,修复过程中可能引入插入或缺失突变,导致目标基因功能丧失,是一种常用的基因敲除方法。 基因插入或替换(Knock in,KI):利用HDR机制,在目标基因上特定位置引入特定的突变或外源序列。这需要提供一个含有预期改变的同源DNA模板,细...
CRISPR-Cas9的技术原理包括gRNA引导的Cas9靶向DNA切割和DNA修复两个基本过程。 首先,Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列,产生DNA双链断裂。 Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件:(1)gRNA的5'端20 nt和靶DNA之间碱基配对;(2) 靶DNA的3'端有合适的PAM...
CRISPR-Cas9技术的操作流程分为四个主要步骤：设计gRNA、构建质粒、转染细胞、鉴定细胞。1.设计gRNA：gRNA是由CRISPR-Cas9系统识别并切割目标DNA的关键部分。我们需要在目标基因中选择一个合适的靶点序列，设计gRNA来引导Cas9蛋白识别并切割该序列。耐思开发的Quick-KO®基因敲除试剂盒根据已知的人和小鼠编码基因，采用...
其工作原理如图所示，清晰而直观。（1）为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，随后将其与经相同酶切处理过的质粒连接。这一步骤中，所使用的酶是DNA连接酶。（2）将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是采用感受态细胞技术。（3）在过程~中，sgRNA与Cas9蛋白会形成复合体。该复合体...
但是,相比CRISPR/Cas9介导的方法,重组工程也有优点,那就是不需要构建sgRNA质粒。有一种方法能结合两者的优点,做到不需要构建sgRNA质粒,同时也能无缝地去除筛选标记。图6形象地展示了这个方法的原理。 【图6】改进版的重组工程 [5] 这个方法的创新之处在于编辑模板的设计。传统的重组工程所用到的编辑模板由两个同源...
CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理:一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割,如图1所示。研究发现恶性肿瘤的发生与TDO2基因编码的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)有关,某研究所采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TDO2基因的部分外显子,从而构建TDO2基因敲除(TDO2-KO)纯合模型小鼠(2n),以期进一步...
解:(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态...
其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA, gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination, HR)方式对切割位点进行修复,实现DNA水平基因敲除或精确编辑。 CRISPR基因敲除...