同源重组是指在DNA分子中,两根具有相似的序列,经过配对形成互补链后进行切割和重新连接的过程。 同源重组载体的构建过程包括以下几个关键步骤: 1.选择载体:选择合适的载体作为DNA重组的平台。常用的载体包括质粒和噬菌体等。 2.获取目的基因:从已知基因库中获取目的基因的DNA序列。 3.选择限制性内切酶:根据目的基因的...
无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 515 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。但需要注意的是，我们在无缝克隆前进行 PCR 扩增的时候，载体与片段之间、片段与片段之间需有 1520 碱基的一...
同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。该方法已经成为分子生物学研究和基因工程中不可或缺的技术手段。具体来说，同源重组构建质粒的步骤如下：1. 选择...
同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。
今天就给大家详解可以一步法快速构建同源重组载体,并且阳性率很高的方式:无缝克隆。【文末有试用福利】 无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法,可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标 DNA 的片断的插入,而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克...
➤目前我们在实验室中比较常用的构建克隆方法大概有以下几种: 🔎传统的质粒重组技术(酶切连接) 传统意义上,质粒重组是基于碱基互补配对的原理,一般做法为: 1)通过引物在目的片段两端引入酶切位点; 2)用相同的限制性内切酶分别对目的片段和载体进行酶切...
基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”的构建过程如下: 第一步:从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞(ES),在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。 第二步:构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因(同源臂),在同源臂上接入neoR(新霉素抵抗基因)等。由于同源臂与...
小立碗藓是具有高效同源重组率的苔藓植物,科学家利用同源重组交换的原理对小立碗藓进行基因敲除来研究某目的基因的功能。基因敲除过程是先构建基因敲除载体,将基因敲除载体导入受体细胞,经过筛选找出基因敲除成功的植株。基因敲除原理如下图所示: 注:抗生素抗性基因表达产物对卡那霉素有抗性;1、2为实现同源重组交换的序...
基因敲除技术是指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。基因敲除技术常用于建立某种特定基因缺失的生物模型。例如,基因敲除模式小鼠制备技术图解如下: ...