半定量RT-PCR试验心得 半定量RT-PCR小结 （一）试验原理 半定量PCR是用于确定目的基因mRNA表达的量，通常以一个管家基因作为参照，传统的方法是将RNA逆转录获得cDNA，然后使用等量的cDNA作为PCR模板，用特异引物进行扩增得到目的基因和管家基因的片段，由于不同组织或细胞等来源的目的基因表达量不同，在同一个PCR体系...
半定量RT-PCR参照的做法一般有两种：1) 将要比较的两个样品的BETA-ACTIN 调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。2) 不进行调平，一个样品里将目的基因和BETA-ACTIN直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简...
首先是内对照和目的基因之间多少存在竞争,其比值本身就不宜定量;第二,结果不能重复,我做了很多次,发现相同的RNA、不同RT-PCR产物的半定量结果极不稳定,就算是同一管PCR产物,扫胶后结果也各不相同,甚至可能差别很大(我们实验室的仪器设备是全国领先的)。 因此鄙人愚见,这一方法不宜定量,以后各位同仁要是想在RNA...
经过对引物核苷酸序列及不同退火温度下PCR产物电泳结果的分析,cGPX基因片断扩增的最佳退火温度均54℃;内参18s r RNA基因片断扩增的最佳退火温度为52℃。 1.2.3.2 循环次数的确定 在RT-PCR方法中,反应的循环次数也是一个必须分析的参数。众所周知,扩增反应最初是线性递增的,但是随着酶活力下降和溶液中反应物的消耗,...
总结我所做的RT-PCR的经验，提高半定量RT-PCR的可靠性或重复性需要注意的几点：1. 提取RNA前确保样品的正确保存，不能有降解。2. 提高RNA的过程中避免RNA酶的污染引起RNA部分降解。3. 提取的RNA需要保证无基因组DNA的污染，因此半定量PCR时需要设置对照组。4. 保证反转录的效率。5. RT-PCR需要做...
目的研究TLR4 mRNA在人大肠癌组织和正常肠道组织之间的差异性表达,探讨TLR4同肠道肿瘤之间的关联性.方法以GAPDH为内参,运用半定量RT-PCR技术检测24例正常大肠组织标本和24例新鲜大肠癌组织标本中TLR4,CD14,MD2,TGF-β和VEGF因子表达水平,应用多媒体图象分析软件进行分析和比较.结果TLR4,MD2,CD14,TGF-β和VEGF在肿瘤组...
１原理 半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术的核心即ＰＣＲ，是２０世纪８０年代末出现的一种相对定量的技术。当人们欲利用该技术研究并揭示某一基因的表达产物量的改变时，利用相同量的ＲＮＡ进行反转录后，再 ＰＣＲ扩增，然后将扩增产物进行电泳判断量的差 异。为避免样本间模板质量和扩增效率的差异而导致最终结果的差异...
方法:应用荧光半定量RT-PCR,检测经SSH结合cDNA芯片分离鉴定的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关基因NYD-Tr在抗性品系与敏感品系中的表达水平.结果:经荧光半定量RT-PCR检测,NYD-Tr进入指数期的循环数抗性品系早于敏感品系.抗性品系组比敏感品系组先进入指数增长期.结论:以NYD-Tr作为靶基因.荧光半定量RT-PCR可区分淡色库蚊...
我们建立了一种半定量 逆转录聚合酶链反应 ( sqR T2PCR) 方法 ,检测了动物 心脏移植模型中 Th1 型细胞因子 IL22 及 Th2 型细 胞因子 IL24 mRNA 的表达水平的变化并获得较好 结果 ,为细胞因子表达 、 其他基因 mRNA 表达及其 变化的研究 ,建立了一种快速 、 灵敏和有效的检测方 法。 [7 ] 1 材料...
我也正在做半定量RT-PCR,也十分关心这个问题。对于你设计不同的引物来扩目的基因得到的大小不同,不知它们之间差别有多大? YangLryyc 我有两条引物,分别得到250bp和400bp的目的片段,PCR 结果很干净没有其他杂带,条带大小也差不多在预计的位置,但就是结论不一致。 YangLryyc 其实同一条引物PCR结果也不稳定啦,...