在进行凝胶过滤柱层析过程中,比凝胶网眼大的分子不能进入网眼内,被排阻在凝胶颗粒之外。比凝胶网眼小的颗粒可以进入网眼内,分子越小进入网眼的机会越多,因此不同大小的分子通过凝胶层析柱时所经的路程距离不同,大分子物质经过的距离短而先被洗出,小分子物质经过的距离长,后被洗脱,从而使蛋白质得到分离。