制备目的片段时常用的方法有两种,方法一是通过PCR扩增片段或者载体上的目的序列,在此过程中,如果制备目的片段是为了在下游进行传统的酶切酶连方式,就需要引入限制性酶切位点,设计与线性载体两端相同的酶切位点,以便酶切后通过匹配的粘性末端进行连接;如果制备目的片段是为了在下游进行同源重组,则需要引入15-25 bp的...
零背景克隆载体通常由表达载体、脱氧核酸多样性片段特异性酶、脱氧核酸测序抗体-聚合物链反应(PCR)及克隆器等构成,一般采用基因组剪接技术,首先将宿主细胞基因组上无法表达的'关注物(如蛋白质)'剪接到表达载体中,然后将其转染到可表达的宿主细胞中,最后使用PCR和克隆技术检测和识别特征的表达,并将其从背景杂质中提取...
一般来说,商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶(如EcoRV)将克隆载体进行线性化,然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应,进行末端的加T。 2自制T载体: 一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下:其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG...
1.一种无假阳性平末端克隆载体的制备方法,其特征在于包括以下步骤: 是用高保真DNA聚合酶扩增模板载体,纯化所得PCR产物即为无假阳性平末端克隆载体。 2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述模板载体为线性化载体。 3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述模板载体为现有载体,或在现有载体的基础上引入了...
1. 一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法,其特征在于:通过设计一对如图2所示 的从引物5/至3/端依次为15-20bp同源臂序列、同一限制性内切酶识别位点和目的基因编 码框扩增序列的引物扩增目的基因,其PCR产物经加A反应后,连接至pUM19-T出发载体中构 建重组克隆载体;采用同一限制性内切酶单酶切重组克隆载体,回收...
其中,制备零背景克隆载体的方法,包括以下步骤:提供SEQ ID NO:6所示的DNA片段;以pUC19质粒为模板,利用SEQ ID NO:7-8所示的引物进行第一PCR扩增,以便获得pUC19载体片段;将DNA片段与pUC19载体片段进行同源重组,以便获得载体骨架;将载体骨架转化感受态细胞并提取质粒,以便获得零背景克隆载体的前载体;以及采用EcoRV酶对零...
同样还可根据所要求的载体应用(扩增、表达等)或其核苷酸插入段之尾部等性质,以及适当宿主来选择之。在一特定的实施方式中,本发明的载体具有多个克隆位点及许多独特的克隆位点,这样将大大有利于整合期望扩增或表达的核苷酸插入段。在另一实施方式中,本发明的载体含有选择标志,如抗生素抗性基因。更可取的是它们含有RK2的...
本发明所述一种基于无缝克隆技术的克隆载体制备方法以及试剂盒,具备以下创新点和技术优势: 1.常用的表达载体构建流程为:使用5′端分别含有不同限制性内切酶识别位点的正反引物扩增目的基因,pcr产物加a反应后,采用t-a克隆技术连接至t载体,测序正确后再采用上述两个限制性内切酶酶切重组t载体,回收双酶切后目的基因片段...
摘要 本发明提供一种基于无缝克隆技术的快速克隆载体、该载体的制备方法以及含有该载体的试剂盒。所述克隆载体的制备方法包括:PCR扩增获得目的基因,PCR产物的特征在于其两末端从外到里依次为任意大肠杆菌表达载体的多克隆位点中单一限制性内切酶酶切位点上/下游15‑20bp的同源序列和同一限制性内切酶识别序列;采用TA克隆...