RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行,一步完成。两步法RT-PCR,RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,分成两步进行。 ▲图1. 一步法...
1.中间产物 cDNA 能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库;2. 通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标，而不需要多重cDNA库;3. 方便对下游条件优化调整，灵活性强;4. 试验成本低。缺点：1. 更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时;2. 相较于一步法，需要进行更多的优化。
两步法RT-PCR (第一步:逆转录反应:,20μl体系,如果是40 " l体系则加倍) 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 11.5μl Oligo(dT)15 0.05μg/μl 2μl 0.005μg/μl ( 0.05μg/μl Oligo(dT)15为Oligo(dT)15原液稀释10倍的浓度) 混匀,离心,70℃5min 立即冰水浴,稍离心 试剂 浓度 体积 终浓度 M一MLV...
实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,即qRT-PCR或qPCR),是对基因和基因转录水平(即RNA)定量的重要方法。对于RNA的定量,需反转录(Reverse Transcription,即RT)和定量(qPCR)两个过程。 根据实验操作步骤的不同,可分为:一步法One-step RT-qPCR、两步法Two-step RT-qPCR。 One-step RT-qPCR 实验过程:RT与qPC...
在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR作为两个单独的反应进行,首先需使用随机引物、oligo (dT)引物甚至基因特异性引物将RNA逆转录为为cDNA,其中使用随机引物或oligo(dT)引物可提供样品中所有RNA种类的cDNA文库。一次反应后的cDNA还可用于其他基因的扩增反应,甚至用于其他应用。使用来自同一逆转录反应的cDNA进行多次PCR更易于...
对于成功的一步法RT-PCR,一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成.一步法 两步法 起始第一链cDNA合成使用:起始第一链合成使用 Oligo(dT) GSP引物 随机六聚体 GSP引物 优点 优点 灵活 方便 引物选择 扩增酶同逆转录酶预先混合 扩增酶的选择 转管步骤少,减少污染可能性 困难RT-PCR的优化能力 高灵敏度 同 ...
两步法rt-pcr搜索 两步法 RT-PCR (第一步: 逆转录反应: , 20μ l 体系, 如果是 40 " l 体系则加倍) 试剂 浓度 体积 终浓度 0. 005 μ g/μ l RNA Oligo(dT) 15 0. 05 μ g/μ l 11. 5μ l 2μ l ( 0. 05μ g/μ l Oligo(dT)15为 Oligo(dT)15原液稀释 10 倍的浓度) 混匀,...
RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库(即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行,一步法完成),省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR,即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。
两步法RT-PCR (第一步:逆转录反应:,20μl体系,如果是40"l体系则加倍)试剂浓度体积终浓度 RNA11.5μl Oligo(dT)150.05μg/μl2μl0.005μg/μl (0.05μg/μlOligo(dT)15为Oligo(dT)15原液稀释10倍的浓度)混匀,离心,70℃5min 立即冰水浴,稍离心 试剂浓度体积终浓度 M一MLVBuffer5x4μl1x dNTP10mM1...
两步法RT-PCR说明书 BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)说明书 Cat No BSB05M1 产品说明 RT-PCR是指利用逆转录酶将RNA逆转录(RT)成cDNA(Complementary DNA)，然后以cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术。RT-PCR技术可用于检测细胞和组织中基因表达水平，克隆特定基因的cDNA序列和检测...