这项技术之所以被称为“一步克隆法”,是因为它能在一个简单的步骤中,轻松地将多个线性DNA片段组装成一个完整的质粒,极大地简化了传统克隆方法的繁琐步骤。是不是听起来很酷? 技术原理 Gibson组装法的神奇之处在于它巧妙地利用了三种酶在同一温度下协同工作的特性: T5核酸外切酶:负责从DNA片段的5'端切割,产生长突...
一步克隆法原理 一步法同源重组是一种利用同源重组的原理,进行无缝克隆的技术。该技术无需考虑酶切位点,几乎适用于任何载体与任何片段的定向克隆。操作过程简单快速,只需50℃,20min即可完成反应。 一步法同源重组是一种利用同源重组的原理,进行无缝克隆的技术。该技术无需考虑酶切位点,几乎适用于任何载体与任何...
通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp(不包括酶切位点)的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。 推荐使用翌圣无缝克隆引物设计软件(http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/),自动生成插入片段的扩增引物。 PCR扩增插入片段,PCR扩...
出现无克隆的现象,可能的原因主要是连接不成功或连接成功,但转化失败。具体原因分别如下: 1、 连接不成功 2、 连接成功,但无克隆 假阳性 出现假阳性的情况,主要表现有两种,克隆不含插入片段或含有错误的插入片段。具体原因分别如下: 1、克隆不含插入片段(空载) 2、克隆含有错误的插入片段 菌落PCR无条带 出现菌落...
翌圣Hieff Clone®系列一步法快速克隆试剂盒运用的是Gibson Assembly同源重组技术,其使用的同源重组酶兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性和连接酶活性。 外切酶活性:该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的15-25 bp的同源序列,并沿着5';→3';方向切割dsDNA,从而产生粘性末端,粘性末端的碱基在50℃作用下进行互补配对,将...
一步法克隆试剂盒连接反应总体系20 μL,但载体/片段浓度低可否使用小体系连接? 可以。翌圣通用型多片段一步法快速克隆试剂盒10923ES,经过大量的内部测试和市场验证,连接反应总体系可以低至6 μL,小体系连接效率高,上市至今客户反馈使用效果好! 小体系高效率重组 ...
一步法快速克隆试剂盒运用到的分子克隆技术是什么? 翌圣Hieff Clone®系列一步法快速克隆试剂盒运用的是Gibson Assembly同源重组技术,其使用的同源重组酶兼具外切酶活性、DNA聚合酶活性和连接酶活性。 外切酶活性:该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的15-25 bp的同源序列,并沿着5';→3';方向切割dsDNA,从而产生粘...
第2期欧阳平等:一种载体构建的新方法:一步克隆法179 基因的序列设计引物,man在其正向引物5'加上pBluescriptⅡSK(+)载体经EcoRI切后3'端15bp 同源序列,即F1:5'—ATCGATAAGCTTGATatgggggagttgcatttgtttaag—3',F2:5'—tcactcaacgatt ggcgttaaag—3';根据pBD—Leu—gfp载体上gfp基因的序列设计引物,在其...
PCR克隆目的 片段后,产生多个首尾具同源末端的片段,然后进行多片段定向连接、转化和重组子鉴定.以4片段拼接的叶 绿体单交换质体载体pSMGA(pBluescriptⅡSK(+)-man-gfp—aadA)的构建为例,应用上述方法构建仅需做 一次连接、转化即可.该方法设计操作相对简便,无需中间载体的构建,减少连接和转化次数.利用该法...
一步法(快速/无缝)克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品,该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点,可高效克隆50 bp～10 kp片段。将载体在克隆位点进行线性化,并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列,使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的...