此外,单克隆抗体与多克隆抗体对于抗原表位识别的差异也可能对WB结果产生影响。 膜的选择 📐应用于WB的常见抗体识别抗原的线性表位,因此上样缓冲液中通常都含有还原剂(如二硫苏糖醇DTT或巯基乙醇2-ME)等,能够打开蛋白的二硫键产生线性表位。部分抗体识别的抗原表位为构象表位,使用此类抗体进行WB需要选择非还原(Non-...
🔍WB条带异常全解析(上) 🔍 在进行Western Blot实验时,条带异常可能是多种原因导致的。以下是一些常见的异常情况及其解决方法: 1️⃣ 非特异性或弥散条带: 抗体浓度过高:尝试降低抗体浓度,特别是针对一抗。 抗体未纯化:确保抗体经过纯化处理。 蛋白上样量过多:减少凝胶上样品的量。 化学发光底物信号过强...
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异常现象:实际检测条带分子量与预期不符。 解决办法:考虑翻译后修饰(PTMs)的影响,使用特异性高的抗体。 注意事项:确保样品处理和抗体孵育步骤的正确性。 条带模糊 异常现象:条带出现模糊,难以准确判读。 解决办法:优化电泳和转膜条件,使用新鲜配制的二抗。 注意事项:避免样品降解和操作过程中的污染。 WB实验中的条...
可能原因 + 解决方案 高背景抗体浓度过高,导致抗体非特异性结合:降低一抗或二抗的波度。 封闭液选择不当:牛奶中含有生物素,不要在亲和素-生物素系统中使用牛奶进行封闭。这会导致背景过高。 在检测磷蛋白时,…
在进行Western Blot(WB)实验时,有时会遇到条带形状异常的情况。以下是可能导致这种情况的原因及相应的解决方法: 1️⃣ 细胞样品制备不当: 在制备细胞样品时,确保彻底弃尽培养液。可以使用培养瓶或培养皿,将细胞用预冷的PBS洗涤几次,以去除培养液中的血清蛋白质干扰。 2️⃣ 裂解液使用不当: 根据细胞种类...
问题解决:回顾实验,制胶采用制胶试剂盒严格按照说明书比例进行配制,故而延长了凝胶时间,重新实验后仍未改善,由此怀疑电流电压不稳。 实验室电泳液的配制为:TRIS(3.02g)+ 甘氨酸(14.42g)+SDS(1g)+ 纯水(1L),怀疑是称量不准导致,换用成品的电泳缓冲液粉后条带立马变直 ...
糖基化蛋白:不司的糖基化通常导致在分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应。靶蛋白中糖基化的潜在位点可见于 PhosphoSitePlus。将样本用PNGase F(糖蛋白上剪切N-聚糖的酶)处理,可确认分子量变化是否因糖基化产生。 裂解物降解:在裂解物中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂,或者建议往裂解缓冲液中加入亮抑酶肽(最终...
配胶是做WB关键一步,使各种液体均匀混合,并从一边将胶加入玻璃板内。凝胶后查看胶的好坏,上缘是否平齐,中间是否存在气泡等等,不论哪种建议从新做胶,不然其他试剂是一种浪费。 4. 条带拖尾。 解决方法:问题由两方面决定,一个是蛋白量过高或一抗浓度过高。建议降低蛋白量,或降低一抗浓度及一抗孵育时间。 不同...