图3: 实时荧光 RT-PCR TaqMan 探针染料检测技术原理图[3] 由于SARS-CoV-2病毒的遗传物质为RNA,故荧光定量RT-PCR技术,在荧光PCR之前,还需再进行一次RNA逆转录,使样品中的RNA链逆转录形成互补的DNA链,之后再进行荧光定量PCR,通过测量Ct值大小实现片段扩增过程中的定量检测,从而反映样品中的病毒RNA含量。 常用的扩...
qRT-PCR法具有高灵敏度、高特异性、适用样本类型广泛等优点,但qRT-PCR结果的影响因素很多,如在磁珠法或柱层析法分离纯化病毒核酸过程中,重复的洗涤、离心、纯化等步骤均可造成相当数量的核酸损失,且增加了核酸断裂水解的可能性;在SARS-CoV-2感染早期,病毒复制数量达不到qRT-PCR检测阈值也会出现假阴性情况[5];而最...
随后,研究人员发现G3BP1与SARS-CoV-2 dsRNA存在共定位现象,敲除G3BP1会显著增加病毒dsRNA的形成。RT-PCR分析表明,敲除G3BP1基因也可提高培养液上清中的病毒基因组RNA水平。此外,在A549细胞中敲除G3BP1会导致病毒复制增加,而G3BP1...
图10:实时荧光定量PCR原理图,图片来源[7],红字为增加的说明 在使用TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR过程中,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;探针被酶切降解后,荧光基团和淬灭荧光基团分离,荧光信号并荧光监测系统监测到。 注意看标注的过程②,探针是被DNA聚合酶水解掉的。整个过程中DNA聚合酶(Taq)...
(1)图中 RT-PCR 是指以病毒 RNA 为模板___合成 cDNA,并对 cDNA 进行 PCR 扩增的过程,需要用到___酶等。 (2)新冠病毒检测结果为阴性也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有___。(至少说出两点) (3)PCR 一般要经历三十多次循环,PCR 的原理是___,在 PCR 体系中___(填“要”或“不需要...
由于核酸检测试剂盒设计时需要在特异性和灵敏度之间平衡,比如使用多重PCR可以提高特异性,但多对引物之间的相互干扰可能会造成灵敏度降低。但如果不使用多重PCR,则一旦所选则的靶位点核酸序列产生突变,就会造成试剂盒失效。因而检测阴性可能与试剂盒的设计...
1、PCR全称为聚合酶链式反应,是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理:DNA复制。前提条件:要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。过程:①高温变性:DNA解旋过程;②低温复性:引物结合到互补链DNA上;③中温延伸:合成子链。 2、就冠状病毒而言,需要比较新病毒和已知病毒在编码的非结构蛋白上的序列...
(2)PCR技术的原理是,一般要经历三十屡次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步,每一个步骤都要控制好相应的温度,延伸的温度复性的温度,而变性的温度(填“大于〞“小于〞或“等于〞)。在循环之前,常要进行一次,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 (3)过程②中对cDNA序列进行扩增,需设计两种引物。以下图...
2.1 RT-qPCR 法检测 SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 核酸检测原理是以病毒特殊的基 因序列作为检测靶标 ,通过 PCR 不断扩增 ,指数级 增加 ,由于引物中有荧光标记 ,每一个扩增出来的 对临床样本进行高通量测序 ,实时分析 ,可对新冠 状病毒实现快速高效的检出 ,有利辅助临床诊断 , 降低医疗压力. 2.4 酶联免疫法...