RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
熔解曲线一般用于染料法,出现单峰说明扩增产物特异性好;出现杂峰特异性差,存在非特异性扩增。若熔解曲线只有单峰且对应温度是退火温度则是靶标发出的荧光,实验结果有效。 图3. 染料法熔解曲线 2)扩增曲线:将已知浓度的靶标稀释几个数量级后进行qPCR反应循环扩增,并用产生的荧光信号与相应浓度生成标准曲线。将未知样本...
一步法与两步法 RT-qPCR RT-qPCR 可以按一步法或两步法进行(图1、表1)。一步法检测是在一个反应管和缓冲液中进行反转录和PCR,同时使用反转录酶和 DNA 聚合酶。一步法 RT-qPCR 仅使用序列特异性引物。在两步法中,反转录步骤和 PCR 扩增步...
RT-PCR其操作方法分为两种,即一步法和两步法。一步法RT-PCR,逆转录同PCR扩增结合在一起,即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行,一步完成。两步法RT-PCR,RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,分成两步进行。
RT-qPCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的,其荧光标记方法分为两种:荧光染料嵌合法和荧光探针法。 1.荧光染料嵌合法 荧光染料嵌合法即应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。常用SYBR Green I染料,该染料在游离状态下几乎不会产生荧光,可以非特异地结合在双链DNA的...
一步法RT-qPCR的优缺点分述 一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物，cDNA 合成与 qPCR 反应在同一管内同一缓冲液条件下进行，一步完成，这种方法能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库，省略了 cDNA 与...
RT-qPCR可以一步法(one-step)或者兩步法(two-step)檢測進行分析(圖1,表1)。一步法檢測同時運用反轉錄酶和DNA聚合酶,將反轉錄和PCR步驟結合於同一個試管與緩衝液中。一步法RT-qPCR僅使用序列特異性性引子。在兩步法檢測中,...
一步法 优点: 1. 由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差; 2. 更少的移液步骤能够减少污染的风险; 3. 适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高。 缺点: 1. 无法分别对两步反应进行优化; 2. 由于反应条件是结合两步反应折中得到的,...
猪传染性胃肠炎(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病以呕吐、腹泻、生长迟缓、饲料转化率降低和脱水为特征,对养猪业造成巨大经济损失。目前,RT-qPCR检测方法已成为猪传染性胃肠炎的常规检测方法,该方法具有灵敏度高...