通常RT primer可分为三类:oligo dT,随机引物和基因特异性引物。根据不同的实验需求选择适合的引物进行使用。 1、如果模板为真核生物来源,且后期cDNA用于常规PCR扩增,建议选择Oligo(dT);若后续实验仅用于qPCR,建议将Oligo(dT)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。 2、如果模板为原核生物来源,反转录请选用Random ...
3. 试剂盒使用时,先用复溶缓冲液溶解冻干粉,再加入自备的RNA模板和引物。 推荐使用MB公司提供的新冠病毒的引物/探针(英文名:SARS-CoV-2 Confirm,货号271-2100) 4. 该试剂盒适合大多数RT-qPCR体系和qPCR仪类型。关于实验使用的最佳体积、浓度、温度和孵育时间,本文有相应的建议,但实验室仍可依据自己的分析要求作...
RT-qPCR包括三大步骤:RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验,可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。 RNA的提取与质量检测 从细胞、组织等样本中提取出RNA后,需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估,质检达标后才能进行后续的实验。一般需要通过紫外...
引物的选择 通常rt primer可分为三类:oligo dt,随机引物和基因特异性引物。根据不同的实验需求选择适合的引物进行使用。 ² 如果模板为真核生物来源,且后期cdna用于常规pcr扩增,建议选择oligo(dt);若后续实验仅用于qpcr,建议将oligo(dt)与随机引物混合后使用,可提高反转录效率。 ² 如果模板为原核生物来源,反转...
当前,Oligo-dT引物和随机引物的混合常是逆转录过程中最佳的选择。 03 缓冲液和dNTP 缓冲液中的离子浓度会影响各种模板的转录效率。一般情况下,用钾离子比用钠离子可获得较长的转录产物。另外,使用dNTP对于有效合成cDNA也是特别重要的。迈迪安提供专门的RT-qPCR ...
4、 引物浓度通常在0.1uM-1.0uM之间优化选择。 ROX的选择: 在定量反应过程中,ROX能够均一化校正仪器的光程差,移液误差或蒸发冷凝导致的体积差等,提高结果的重复性。但需要注意的是ROX的选择与仪器相关,如果qPCR仪有自动校正孔间差的功能,就不需要添加ROX,反之则需要添加ROX校正。小伙伴们在买试剂时一定要根据所用...
RT-qPCR是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA; 2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA; 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint): 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性 ...
2引物浓度通常在0.1uM-1.0uM之间优化选择。 ROX的选择 在定量反应过程中,ROX能够均一化校正仪器的光程差,移液误差或蒸发冷凝导致的体积差等,提高结果的重复性。但需要注意的是ROX的选择与仪器相关,如果qPCR仪有自动校正孔间差的功能,就不需要添加ROX,反之则需要添加ROX校正。小伙伴们在买试剂时一定要根据所用的仪...
实时定量PCR(qPCR):通常使用DNA模板浓度为1-100 ng,引物和荧光探针的浓度为0.1-0.3 μM,反应体系总体积为10-25 μL,反应温度通常为95°C的变性,50-65°C的退火,以及72°C的延伸。实时监测PCR信号的周期数(Ct值)可以定量PCR产物的数量。 3.逆转录PCR(RT-PCR):RT-PCR是一种用于从RNA模板合成DNA的技术。
RT-qPCR包括三大步骤:RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验,可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。 RNA的提取与质量检测 从细胞、组织等样本中提取出RNA后,需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估,质检达标后才能进...