知识,RT-PCR那点东西,全在这⾥。RT-PCR相对定量有两个模型,⼀是ΔΔCt 模型,⼀个是扩增效率校正模型。这⾥我们先讨论简单的模型:ΔΔCt 模型,在这⼀模型中,假定扩增效率为2,即每个PCR cycle,产物倍增,由以下公式给出:Ratio=2−ΔΔCt 其中ΔΔC t = ΔΔC treated - ΔΔC ...
如果是目的基因和内参基因的扩增效率相差比较大,可以用扩增效率进行校正,也就是Pfaffl方法。所用公式如下: 处理所致倍数变化(fold change)= C(A-E)/D(F-B) 扩增效率(E)=10-1/斜率(理想的PCR扩增效率=2) 百分比表示为:e%=(E-1)×100% 同时是上面例子,如果Cdk5的扩增效率是70%;GAPDH的扩增效率是95%,那...
荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法,他的计算方法有很多,常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法,ΔCt法,2-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的2-ΔΔCt法(Livak法): qRT-PCR介绍及计算公式 该部分引用自下方参考链接1 qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程...
我们开发了两种通过使用序列检测系统(SDS)仪器进行PCR产物检测的试剂: Applied Biosystems TaqMan 试剂(也称“荧光5’核酸酶试剂”) Applied Biosystems SYBR Green I染料试剂 TaqMan方法 TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
最后,计算表达水平比率: 2-△△CT表达量的比值 如果目标和内参基因的扩增效率不相近,可以优化或重新设计实验,或者可以采用Pfaffl法。另外,如果目标基因和内参基因有相近的扩增效率,但是扩增效率不等于2,那么,2-△△CT(Livak)方法的公式可以修正为实际的扩增效率代替公式中的2。 方法二:Pfaffl法 条件:每个基因(目标...
附上R的完整公式: R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample) 其中,E1:目的基因引物扩增效率;E2:内参基因引物扩增效率;△Ct1:实验组目的基因Ct值差;△Ct2:对照组目的基因Ct值差。 你观察这个公式时候就发现,当扩增效率E为1(即100%)时,该公式就等于2^-△△Ct,这就是为什么会有2...
根据基因表达量的计算公式,基因表达量=2^-△△Ct,其中△△Ct=△Ct(实验组)-△Ct(对照组) 例如: 验证基因A的敲低效果,实验分为两组:对照组和实验组。每个样本设置三个复孔,通过PCR仪的检测得到Ct值,先根据公式计算出△△Ct值,再计算出基因的表达量,取对照组的表达量的平均值,让所有的数据除以平均值,这样...
cDNA稀释5倍,β-actin作为内参基因,检测基因的相对表达量。 real-time PCR 反应体系 qPCR程序设置 根据2-ΔΔCt 法对数据进行相对定量分析,计算公式如下(x表示任意一个样本):ΔΔCt = (Ct.Target – Ct.内参)X – (Ct.Target – Ct.内参)Control。 实验结果: 生物实验 qPCR检测...
扩增效率(Eff)可以通过以下公式进行计算: Eff = 10 (–1/slope) –1 PCR的效率应当在90-110%之间(3.6 > 斜率 > 3.1)。有一系列变量会影响到PCR的效率。举例来说,这些因素包括扩增子的长度、二级结构以及引物设计等。尽管扩增效率落在上述范围之外时,我们也可以得到有效数...