1. Total RNA was extracted using a Trizol reagent (Invitrogen). RNA (2 μg) was converted into cDNA using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo). QRT-PCR was accomplished using the FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche) in the ABI PRISM® 7300 real-time PCR...
步骤 1.提取RNA:RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。 2.逆转录:逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。逆转录反应需要逆转录酶和引物。在逆转录反应中,RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。 3.退火:将逆转录产生的单链cDNA进行退火,以得到双链cDNA。退火的温度和时间应...
以下是RT-PCR的一般步骤: 1. 样品处理,首先需要从样品中提取RNA。这包括细胞或组织的裂解以释放RNA,并使用适当的试剂将RNA纯化出来。 2. 逆转录,提取的RNA经过逆转录反应,使用逆转录酶(如M-MLV逆转录酶)将RNA转录成相应的cDNA(互补DNA)。 3. PCR准备,为了进行PCR,需要将逆转录产生的cDNA与引物(primer)和DNA...
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。在完成逆转录过程之后，通过PCR进行定量分析的时候，随着技术的...
1从供体生物特定分化型组织或细胞中提取纯化总RNA,其中目的mRNA为高丰度mRNA;2以Oligo(dT)为引物,以总RNA中的总mRNA为模板,在反转录酶作用下合成互补的总cDNA;3变性:升温至94~95°C加热5min,使总mRNA : cDNA的杂交链由于热变性而分开成单链;4退火:降温至40~60°C,加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷...
实验步骤 一、总RNA的提取 总RNA提取可以:(1)获得高纯度、高质量的总RNA;(2)可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR和阵列分析所需。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preampli...
RT-PCR步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心，10min。在管...
下面将介绍RT-PCR的操作流程。 首先,准备实验所需的试剂和设备,包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。 第二步是提取RNA样本。将待检测的样本(如血液、组织等)加入RNA提取试剂盒中,按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。提取后的RNA样本应该是纯净的,...