多重检测限制:传统的RT-PCR技术通常只能同时检测少数几个基因,难以实现大规模的多重检测。虽然近年来出现了多种高通量的RT-PCR技术,如微阵列PCR和数字PCR等,但这些技术仍存在一定的局限性和挑战。 综上所述,RT-PCR技术在生物医学研究和临床应用中具有重要地位,但也存在一些需要克服的缺点和挑战。在实际应用中,需要...
当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时（在延伸阶段），探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成...
而且在RT-PCR中使用的是基因特异性引物,有助于最大化目标cDNA的得率,并最小化扩增背景,常用于分析低表达水平基因。由于该法的检测结果准确率高,因而在需要测量表达水平上的细微差异时,也可采用此方法。 2、缺点 一步法RT-PCR采用基因特异性引物进行扩增,将分析局限于每个RNA样本中的几个基因。由于反应需兼顾逆...
普通PCR用于扩增DNA片段,逆转录PCR用于从RNA转录成DNA,而荧光定量PCR可以用来准确测量DNA或RNA的浓度。其次,还有特定领域中常用的PCR分类,如实时荧光PCR、多重PCR和数字PCR。实时荧光PCR可以实时监测PCR反应的进行,多重PCR可以同时扩增多个目标序列,而数字PCR则可以准确计算样本中目标序列的拷贝数。在分子生物学和医学研...
优点:检测特异性强;灵敏度高;适合进行多重qPCR检测;PCR后续无需处理,节省时间和原料成本。 缺点:需要根据不同的序列,合成不同的探针;探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性,定量时容易受试剂和酶性能影响;淬灭难以彻底,本底较高;检测结果很难判断实际的扩增特性。
尽管具有主要优点,但 RT-PCR 并非没有缺点。由于难以保持线性,反转录互补 DNA (cDNA) 在多个 PCR 循环期间呈指数增长,导致终点定量不准确。为了准确检测和定量样品中的 RNA 含量,使用基于荧光的修改开发了 qRT-PCR,以监测每个 PCR 循环期间的扩增产物。该技术的极端敏感性可能是一把双刃剑,因为即使是最轻微的 DN...
▲图1. 一步法和两步法RT-PCR的比较 两种方法如何选择及优缺点对比 RT-PCR中模板的选择 在RT-PCR 实验中,选择总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。mRNA虽然能提供略高的灵敏度,但总RNA经常使用,具有较mRNA更重要的优势。第一,其过程需要较少的纯化流程,...
优点：1.中间产物 cDNA 能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库;2. 通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标，而不需要多重cDNA库;3. 方便对下游条件优化调整，灵活性强;4. 试验成本低。缺点：1. 更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时;2. 相较于一步法，需要进行更多的...
RT-PCR(real-timepcr)在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点RT-PCR(real-timepcr)在检测细胞的凋亡中与其他方法相比有何优缺点病情描述:做视网膜中bcl-2和bax两个因子用TR-PCR和其它的方法比如免疫组化相比有何优缺点,多说一点优点。专家意见:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相...