荧光定量 PCR(qPCR)的检测灵敏度是衡量其性能的核心指标,直接影响低浓度靶标的检出能力。结合新研究及行业实践,检测灵敏度主要受以下 5 大维度影响: 一、 仪器硬件性能:灵敏度天花板温控模块 材质与导热性:…
被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。5、RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，在cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。
5. 实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR...
实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针,当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号,从而可以对目标序列进行量化。荧光定量PCR其本质是通过荧光探针或荧光DNA结合染料和实时荧光定量PCR仪器对PCR扩增产物进行检测和定量,仪器在PCR热...
实时荧光定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)是一种结合传统PCR与实时荧光检测的核酸扩增技术。自1996年首次报道以来,该技术凭借高灵敏度、高特异性、定量准确及操作简便等优势,迅速成为分子生物学、医学诊断、食品安全等领域的核心工具。值得注意的是,qPCR也称为Real-Time PCR,但需与RT-PCR(Reverse Transcription PCR)严...
实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）在分子生物学研究中具有广泛的应用，能够准确、迅速地定量目标DNA。为了确保qPCR实验结果的准确性和可靠性，提高实验的灵敏度至关重要。本文将介绍一系列有效的方法，帮助您在提高qPCR实验灵敏度的同时，避免与之前的写作内容相似，以确保文章通过查重。一、引物设计的改进 特异性引物...
在选择和使用实时荧光定量PCR（qPCR）时，有几个关键参数需要考虑，以确保实验的准确性、灵敏度和重复性。以下是这些关键参数的详细说明：一、引物和探针设计 1、特异性：引物和探针应特异性结合目标序列，避免非特异性扩增。2、效率：引物对的扩增效率应接近100%，通常在90%-110%之间。3、退火温度：引物的退火温度...
使用荧光定量PCR仪在进行qPCR实验时，引物的设计至关重要。使用引物设计软件进行设计时，需在操作界面上设定相应的参数，扩增子参数一般设定范围为80～200bp。扩增子长度越短，扩增效率越高，可选择设定在110bp。引物一般由试剂公司合成，为干粉状态，在溶解前，最好用高速离心机低温快速离心30s，使得引物干粉汇聚到管底...
优点:检测特异性强;灵敏度高;适合进行多重qPCR检测;PCR后续无需处理,节省时间和原料成本。 缺点:需要根据不同的序列,合成不同的探针;探针的水解依赖Taq酶外切酶的活性,定量时容易受试剂和酶性能影响;淬灭难以彻底,本底较高;检测结果很难判断实际的...
优点:检测特异性强;灵敏度高;适合进行多重qPCR检测。 缺点:需要根据不同的模板序列,合成不同的探针;靶序列浓度极低或存在大量非特异性扩增时,无法准确定量。 图3 荧光探针法的工作原理 3. 逆转录PCR( Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR) ...