⑪ 接下来就可以根据文库的大小,扩培需要的 Cas9 细胞量。 *注意:Cas9 稳转株构建好后,建议使用之前验证过的 sgRNA 进行编辑效率测试,编辑效率直接决定后续筛选的效果。 5. sgRNA 文库病毒包装 所需材料: 293T 包装细胞 (建议代次< 15 代) 转染质粒: CRISPR library 质粒, psPAX(包装质粒 Addgeneplasmid#12...
2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动...
2022年3月,Takashi Ishio等人在Blood发表“Genome-wide CRISPR screen identifies CDK6 as a therapeutic target in adult T-cell leukemia/lymphoma”,该研究使用Brunello慢病毒sgRNA表达文库筛选发现:多个成人T细胞白血病淋巴瘤(Adult T-cell leukemia/lymphoma, ATLL)特异依赖的关键基因,并针对CDK6深入探究,证明TP53...
CRISPR/Cas9文库筛选技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计3-10条sgRNA，利用芯片一次性合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA探针，通过克隆构建载体库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，使得理论上每个细胞整合一条sgRNA，构建获得覆盖全基因组的基因敲除细胞池；经过筛选后，提取基因组并针对整合...
CRISPR/Cas9文库筛选基本流程 1. sgRNA文库的设计与合成:确定待研究的基因列表,选择合适的sgRNA设计软件(如CRISPR-FOCUS、CHOPCHOP、CRISPR library designer(CLD)、Cas-designer等)。为确保基因能够被编辑,每个基因一般设计4-6个sgRNA。 2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞:将sgRNA文库进行慢病毒包装,并以较低的病毒...
运用CRISPR/Cas9 高通量筛选技术在肿瘤细胞进行的阳性或阴性筛选,可以对靶向候选基因(编码和非编码基因)导向RNA(GRNA)进行富集,进而寻找感兴趣的目的基因。该技术的完整流程包含以下步骤:慢病毒文库构建,文库病毒感染细胞,细胞实验筛选,基因组DNA提取与二代测序文库构建,二代测序与生物信息学分析。
图2.慢病毒混合筛选工作流程。使用 LentiArray 慢病毒 Cas9 核酸酶选择杀稻瘟素抗性,生成表达 Cas9 的稳定细胞系。然后,以适当的 MOI 值用 LentiPool sgRNA 文库转导这些 Cas9 表达细胞,并进行嘌呤霉素抗性选择。然后对转导的细胞群施加选择性压力或处理,如药物或化学扰动物质。分离基因组 DNA 并通过 PCR 技术扩增...
CRlSPR/Cas9gRNA文库筛选是利用CRlSPR/Cas9技术建立的动物全基因组或某类相关基因的gRNA文库，通过慢病毒侵染方式导入目的细胞，对细胞进行编辑，然后功能性筛选和富集细胞，通过NGS测序和生信分析的手段，筛选出具有特定功能的基因。gRNA文库筛选技术具有高效、精准、高通量等特点，目前已被广泛应用于疾病研究、药物开发...
CRISPR/Cas9文库筛选技术可实现全基因组范围的高通量筛选,其针对每个基因设计3-10条sgRNA,利用芯片一次性合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA探针,通过克隆构建载体库,经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞,使得理论上每个细胞整合一条sgRNA,构建获得覆盖全基因组的基因敲除细胞池;经过筛选后,提取基因组并针对整合的sgRNA...
常用的筛选技术包括CRISPR敲除筛选，激活筛选，抑制筛选。高通量sgRNA文库筛选流程 CRISPR敲除筛选 在CRISPR-Cas9的作用下通过NHEJ或HDR进行全基因组不可逆基因消融，然后筛选由此产生的表型改变。CRISPR激活筛选 通过CRISPR-dCas9在不扰乱基因组序列的情况下进行全基因组可逆基因激活，通常采用额外的调控域，然后筛选由此产生...