CRISPR/Cas9实验设计方法 是一项可对基因组特定靶基因进行编辑的DNA操控技术,该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,Cas9蛋白在sgRNA的引导下对靶位点处的DNA双链进行剪切,并产生一个平末端的双链DNA缺口,进而启动DNA损伤修复机制,通过非同源末端链接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)的方...
实验步骤详解：质粒构建：首要步骤是构建一个包含CRISPR-Cas9系统的质粒，其中特别重要的是lentiCRISPR-sgRNA。这个质粒携带了sgRNA序列，它能够指引Cas9蛋白精确地识别并切割目标基因。慢病毒包装质粒准备：接着，需要准备好慢病毒包装质粒，这些质粒包括pCMV-VSV-G（携带包膜蛋白）和pCMV-dR2 dvpr（携带包装蛋白）。这...
The surveyor assay of insertion and deletion分析 CRISPR/Cas9 系统在特定位点的作用效率 CRISPR/Cas9 系统在真核细胞中切割会造成 DNA 双链的断裂,我们采用 Dmitry Y.Guschin 等人用来分析 zinc finger nucleases (ZFN)造成的基因突变得方法来分析CRISPR/Cas9 系统作用效率。这种方法依赖于Surveyor nuclease的功能。...
crispr-cas9基因编辑技术大体上有三种技术路线：All in one质粒转染法，病毒转化法，RNP复合物导入法。病毒转化法是将sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白的序列整合进病毒中，再使用病毒感染细胞。相较于质粒转染法，优点在于sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白可以持续存在于细胞中，从而达到一个很高的基因编辑效果。图2 慢病毒转染细...
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切...
CRISPR-Cas9实验流程如下: 1.设计sgRNA:根据目标基因的序列,设计合适的sgRNA。sgRNA是一段引导Cas9蛋白到特定DNA序列的RNA分子。 2.合成sgRNA:可以通过化学合成或体外转录的方法合成sgRNA。 3.构建CRISPR-Cas9表达载体:将sgRNA和Cas9蛋白的编码序列构建到合适的表达载体中。 4.转染细胞:将构建好的CRISPR-Cas9表达载体转...
保存方式:-20 °C 低温冻存,避免反复冻融,长期请置于-80℃保存,实验过程置于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。 二、CRISPR-Cas9全RNA体系操作方法 因不存在DNA插入的风险,riboEDIT™ CRISPR-Cas9全RNA体系是一种更安全的基因编辑工具并已申请专利。riboEDIT Cas9 mRNA是体外转录生成的Cas9 mRNA,...
一、利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系实验的详细过程 1.1 确定待敲除基因的靶位点 1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo(引物) 1.3 构建表达sgRNA的质粒 1.4 sgRNA活性检测 1.5 利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系 1.1、确定待敲除基因的靶位点
二、实验流程 制备带有gRNA的caripr/cas9腺病毒穿梭质粒,分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,共转染293FT细胞,转染后6h更换为完全培养基,培养十几天,在中间四五天左右更换一次新鲜培养基,然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后,液氮/37度冻融三次(冻-融要彻底),2000rpm离心5分钟,取上清即为病毒液...
Crispr/Cas9进行基因编辑流程图 1、gRNA根据NGG原则设计,一般选择外显子上的序列进行设计,可以利用网站设计,多设计几个,以防编辑效率过低或不起作用。质粒有现成的,可以直接从公司购买,不用自己设计。将gRNA和质粒按照质粒说明书进行连接,转化感受态大肠杆菌,根据质粒抗性选择对应的抗生素添加到培养基中进行阳性克隆筛选...