⑤新兴技术与未来展望:近年来,CRISPR技术不断发展,出现了高保真CRISPR系统、碱基编辑技术、先导编辑技术等新兴技术。未来,CRISPR技术有望在治疗遗传性疾病、提高农业生产、应对气候生态挑战等领域发挥更大作用。 图1:2020年诺贝尔化学奖得主(来源:新华社) 2 C...
CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生DSB (双链断裂),DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础,CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术,就是因为只需要改变sgRNA的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性,设计和操作十分方便。 基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法 和其它基于核酸内切酶的基因编辑技术类似,基于CRISRP Cas9的基因编辑...
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理 CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割，造成双链DNA断裂，然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR）...
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理 CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割,造成双链DNA断裂,然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复,即非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR),而...
图1. CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图 二、敲除单克隆细胞株的构建 1. 确定基因,选择合适的细胞系 根据研究内容确定待敲除的目的基因和细胞系。敲除前应首先通过网站查找预测、文献查阅等明确待敲除基因的功能并评估敲除此基因是否致死;在细胞系的选择上,优先选择容易转染且单克隆增殖能力较强的细胞。
在基因编辑技术的CRISPR/Cas体系中，基于同源介导修复 (homology directed repair, HDR) 机制开展的基因敲入是其重要应用之一，合适的HDR模板是决定基因敲入成败与效率的重要因素。三、CRISPR基因敲入实验流程步骤 （以敲入RFP蛋白为例）1. 构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒 （1）确定敲入位点 ①若敲入的片段不参与...
图1展示了这个方法所对应的Cas9基因组编辑系统。 CRISPR Cas9基因编辑的基本步骤大致是: (1) 将宿主菌株制备成感受态细胞,宿主菌株的基因组上提前整合了λ-Red重组系统,在制备感受态细胞的过程中诱导重组酶表达; (2) 将质粒pCas9cur、质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入宿主细胞中,或者将质粒psgRNA和线性Donor DNA共...
CRISPR/Cas9技术，作为一种高效的基因编辑手段，其核心成分Cas9基因所表达的Cas9蛋白，宛如一把精准的“分子剪刀”。在单链向导RNA（sgRNA）的精准引导下，这把“剪刀”能够高效地切割DNA双链，从而实现目标基因的敲除或新基因的插入。其工作原理如图所示，清晰而直观。（1）为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定...
单碱基编辑技术基于CRISPR/Cas9系统，在不产生双链断裂的前提下，对DNA的单个碱基进行替换，从而达到基因组位点矫正的效果。因为不产生DSB现象，故此出现碱基插入、缺失或移码等非目标突变的情况会大大降低，因而具备高效且精准的基因编辑能力，对于单碱基突变导致的疾病具有重大意义。汉恒专营工具病毒十余载，可定制用于...