CRISPR-Cas9基因编辑技术主要有两种应用方式: 1.基因敲除(Knockout):通过CRISPR-Cas9在目标基因上引入双链断裂(DSB),细胞通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制修复断裂,过程中可能引入插入或缺失(indels)突变,导致目标基因功能丧失。 2.基因插入或替换(Knockin):利用同源重组(HDR)机制,在目标基因上引入特定的突变或外源序...
使用基因转染、电穿孔或病毒介导转导等方法将CRISPR/Cas9系统导入目标细胞。 根据细胞类型和转染效率选择合适的转染方法。 筛选和鉴定基因编辑细胞 使用特定的筛选标记(如荧光蛋白或抗生素抗性基因)富集成功转染的细胞。 通过分子生物学方法(如PCR和测序)验证目标基因的编辑情况。 筛选出具有目标基因敲除、插入或替换的细胞...
CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生DSB (双链断裂),DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础,CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术,就是因为只需要改变sgRNA的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性,设计和操作十分方便。 基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法 和其它基于核酸内切酶的基因编辑技术类似,基于CRISRP Cas9的基因编辑...
RISPR/Cas9技术极大方便了基因编辑的操作。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑,其基本原理为:第一步先对需要编辑的位点进行切割,造成DNA断裂;第二步用细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复。从而产生需要的突变结果。 目前主要有两种方式进行基因敲除:通过邻端接合反应敲除目的基因...
今天我们要谈的便是目前最前沿、最有效的基因组编辑方法——CRISPR/Cas9。我们将简单阐述CRISPR/Cas9技术的理论背景和主要应用,希望能对大家的研究有所启发。 (一)CRISPR系统介绍 CRISPR是“成簇规律间隔短回文重复序列”(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的缩写,原核生物(细菌和古生菌)利用它...
CRISPR/Cas系统是应用最广泛的基因组编辑技术。 由具有核酸内切酶功能的Cas蛋白和一条人为重组的一段目的基因的单链向导RNA(sgRNA)组成,sgRNA可以指导Cas蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。 其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入,应用最成熟的一种高效的基因编辑工具,主要...
1 随机剪切的基因组 DNA 被环化，然后用 Cas9 切割. 只有具有切割位点的分子才会进入文库制备、PCR 扩增和 NGS 的后续步骤，以揭示易受 Cas9 切割影响的序列。作为一种体外试验，CIRCLE-seq 避免了 CRISPR QC 基于细胞的方法中冗长的细胞培养步骤。此外，CIRCLE-seq 是一种可扩展、灵敏的技术，与其他体外方法相比...
1. 基因敲除（Knockout）：通过NHEJ修复机制，CRISPR/Cas9可以引入小的插入或缺失突变，从而破坏基因的功能，实现在细胞或生物体中敲除特定基因的目的。这对研究基因功能和疾病模型的建立非常有用。2. 基因编辑和基因修复：通过HDR修复机制，研究人员可以使用CRISPR/Cas9引入特定的DNA序列以修复突变基因或插入新的基因。