CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生DSB (双链断裂),DSB是一切基于核酸内切酶的基因编辑的基础,CRISPR/Cas9之所以颠覆了以往的基因编辑技术,就是因为只需要改变sgRNA的5'端序列即可重编程Cas9的序列特异性,设计和操作十分方便。 基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法 和其它基于核酸内切酶的基因编辑技术类似,基于CRISRP Cas9的基因编辑...
将携带CRISPR/Cas9的质粒递送到特定细胞中需要载体,而载体需要满足以下特点才能在体内有效:(1)载体必须在血液中保持稳定,而不会降解或免疫清除,(2)载体随后在候选物组织中积累并触发细胞内吞作用,以及(3)CRISPR系统将溶酶体逃逸到细胞质中以执行基因组编辑或调节基因表达...
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理 CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割，造成双链DNA断裂，然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directed repair, HDR）...
解析:核糖体是蛋白质合成的场所,因此Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成,作用是破坏磷酸二酯键,A正确;向导RNA与基因形成的双链区碱基对之间遵循碱基互补配对原则,B正确;向导RNA通过转录形成,需要RNA聚合酶的催化,而逆转录酶催化以RNA为模板合成DNA的...
图1. CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图 二、敲除单克隆细胞株的构建 1. 确定基因,选择合适的细胞系 根据研究内容确定待敲除的目的基因和细胞系。敲除前应首先通过网站查找预测、文献查阅等明确待敲除基因的功能并评估敲除此基因是否致死;在细胞系的选择上,优先选择容易转染且单克隆增殖能力较强的细胞。
图1. CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图 二、敲除单克隆细胞株的构建 1. 确定基因,选择合适的细胞系 根据研究内容确定待敲除的目的基因和细胞系。敲除前应首先通过网站查找预测、文献查阅等明确待敲除基因的功能并评估敲除此基因是否致死;在细胞系的选择上,优先选择容易转染且单克隆增殖能力较强的细胞。
CRISPR/Cas9技术，作为一种高效的基因编辑手段，其核心成分Cas9基因所表达的Cas9蛋白，宛如一把精准的“分子剪刀”。在单链向导RNA（sgRNA）的精准引导下，这把“剪刀”能够高效地切割DNA双链，从而实现目标基因的敲除或新基因的插入。其工作原理如图所示，清晰而直观。（1）为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定...
CRISPR-Cas9技术的这些基本原理使其成为一种强大的基因编辑工具,能够在多个生物学系统中进行高效和精确的基因修改。通过这种技术,科学家们能够探索基因的功能,治疗遗传病,甚至创建经过改良的作物和动物模型。 技术应用: CRISPR-Cas9技术的应用领域广泛,从基础科学研究到临床应用、农业和生物工程等多个领域都有显著的影响...
图1展示了这个方法所对应的Cas9基因组编辑系统。 CRISPR Cas9基因编辑的基本步骤大致是: (1) 将宿主菌株制备成感受态细胞,宿主菌株的基因组上提前整合了λ-Red重组系统,在制备感受态细胞的过程中诱导重组酶表达; (2) 将质粒pCas9cur、质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入宿主细胞中,或者将质粒psgRNA和线性Donor DNA共...