Co-IP结果如何看？_Co-IP（免疫共沉淀）与GSTpull-down区别Co-IP是检测分⼦间相互作⽤的常⽤技术，德泰发现有很多实验⼈员反映在查看论⽂⽂献的过程 中，遇到Co-IP实验结果图不知道如何进⾏分析。本⽂从不同的⽂献中找了四个Co-IP的结果 图，⽤案例的⽅式对如何分析Co-IP实验结果图进...
随后观察IP组,该组图表示的是利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀,图上显示两组实验在130kd都存在蛋白,说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。 最后观察Co-IP实验组,该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签,图上显示第一组实验没有条带,而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共...
5、 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃1 h以去除非特异性杂蛋白,降低背景。 6、4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中标号Input,留Protein A珠子,标号IP。 7、变性以及还原蛋白 室温溶解蛋白上样缓冲液(5×),按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合,IP组...
整个过程需要在冰上操作;IP样本一般建议新鲜制备并立即使用,如有需要可保存在-80 ℃。 2)预纯化 阴性对照的选择: 与IP抗体同源同型(亚型)的抗体:如 Rabbit IgG;Mouse IgG1, etc; 取与IP实验等量的裂解液,使用Isotype Control孵育;与IP抗体孵育同时进行。 Isotype Control选择: 预纯化的目的: 减少裂解混合物中...
IP-MS不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。2、实验步骤 IP-MS的实验流程如下图所示，包括：（1）材料获取：细胞或组织。（2）蛋白提取：可根据目的蛋白的特性加入不同类型的IP裂解液及抑制剂。如：非磷酸化蛋白可不添加磷酸酶抑制剂；IP背景高，选用裂解...
6、4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中标号Input,留Protein A珠子,标号IP。 7、变性以及还原蛋白 室温溶解蛋白上样缓冲液(5×),按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合,IP组加入50ul蛋白上样缓冲液,在蛋白样品中加入含SDS(保证样品中的所有蛋白带电荷一致)的上样缓冲液,100℃加热煮沸,以...
整个过程需要在冰上操作; IP样本一般建议新鲜制备并立即使用,如有需要可保存在-80 ℃。 2)预纯化 阴性对照的选择: 与IP抗体同源同型(亚型)的抗体:如 Rabbit IgG;Mouse IgG1, etc; 取与IP实验等量的裂解液,使用Isotype Control孵育;与IP抗体孵育同时进行。
总结：从这个案例中，我们可以了解到，在日常的研究过程中，通过酵母双杂筛库获得目的蛋白的潜在互作蛋白后，可以通过Co-IP来进一步验证蛋白与蛋白的相互作用。>>>案例二 2018年12月4日，朱健康教授团队在PNAS上发表了题为：Leucine-rich repeat extensin proteins regulate plant salt tolerance in Arabidopsis的研究论...
为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是假阳性，在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的对照。假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+蛋白X+蛋白Y”，则可能出现的假阳性及对应需要设置的实验对照如下表所示：除此之外CO-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体...
注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4) 亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) ...