最重要的是 beads 孵育时间一般 1.5-2 小时就可以了,孵育时间过长一是可能会是蛋白沉淀,沉淀后的蛋白不容易与 beads 分开最终进入洗脱液中,二是可能会有蛋白与 beads 的非特异性结合。 另外有些同学不知道 Co-IP 之后什么时候选择 western 验证, 什么时候用质谱(MS)检测? Western 是 Co-IP 试验后一直使用的...
· 向DNA/血清无培养基中加入20µL预热的PEI，室温孵育15分钟。更换细胞培养基为3mL转染培养基，并将转染混合物均匀滴入细胞中。培养基更换（Day 1）· 转染24小时后，用含CaCl2和MgCl2的PBS洗涤细胞去除未转染的DNA，再添加新鲜培养基。收获细胞及梯度分离IP（Day 2）· 使用NMPH裂解液（分离核糖体并释放新生...
孵育一抗（PBS稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min。孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1 h。...
步骤1:若使用Flag磁珠,将含有0.2-1 mg/mL Poly Flag多肽的TBS缓冲液加入洗涤后的产物中,缓冲液体积为磁珠使用量的5倍。4℃摇床孵育洗脱2-6小时(为了提高洗脱效率,可延长孵育时间或重复洗脱)。 步骤2:将上述步骤得到的产物进行磁性分离,将包含目的蛋白的上清转移到新的EP管中,重复洗脱步骤一次以获得更高的回收率...
控制对于了解您的实验是否有效并在事情没有完全解决时进行故障排除至关重要。 您可以为 Co-IP 使用多种不同的控件(图 2)。 图2:免疫共沉淀的示例对照 阴性对照 这些控件表明您在实验中看到的任何交互都是有效的。 使用涂有非特异性抗体的珠子,在您的裂解物中孵育并与您的样品一样处理。 最好从与实验中的抗...
1、co-ip一、裂解细胞1、收集细胞 1000rmp,5min,rt2、pbs 洗,离心 1000rmp,5min3、加 400ul ip lysis buffer(0.1triton)1:25 加 cocktail冰上孵育 30minip lysis buffer 500ml:hepes5.95gnacl4.38gegta0.38g ph=7.44、针头过 5 次,冰上,旋转孵育,15min5、12000rpm,20min,4 度,留上清,去沉淀留取 1...
ProFound? c-Myc Tag IP/Co-IP Kit 包含了⾜够25个与c-Myc –标签蛋⽩IP或Co-IP的成分，包括10个c-Myc –标签阳性对照的实验 试剂盒成分：Immobilized Anti-c-Myc, 62.5 g固定的珠状琼脂加上125g 抗体，以含25%的溶液和0.1%叠氮钠的PBS 的形式提供(总体积为250ul)。BupH? Tris Buffered Saline...
注:抗体浓度根据说明书或者预实验结果,取决于抗体的效价。如果目的蛋白或相互作用蛋白在55KD和25KD左右,应选用不同种属的抗体分别做IP和IB以避免重链和轻链的干扰。 2. 将EP管在4℃条件下孵育1-12小时,推荐在温和搅拌或旋转条件下孵育。 注:孵育时间取决于目的蛋白浓度和抗体的亲和性。如果目的蛋白抗体已经偶联珠...
将一定量预处理过的protein A/G琼脂糖珠加入经抗体孵育的裂解液,继续于4℃摇床孵育2-4h或过夜,离心后弃上清,保留沉淀,并将沉淀洗涤3次。最后加入适量loading buffer煮5-10min 4.研究动态蛋白质相互作用 通过在不同时间点或响应特定刺激进行Co-IP实验,深入了解蛋白质相互作用的时间调控、调控强度、丰度和化学计量...