为了减少脱靶，可选择一些高保真变体如通过突变降低脱靶活性的SpCas9-HF1、eSpCas9、HypaCas9等；传统的Cas9蛋白包含RuvC和HNH两个催化结构，RuvC和HNH可分别剪切DNA的两条链形成双链断裂，采用CRISPR/Cas9n系统（如Cas9 D10A变体),仅在一条链上产生单链切口（Single-strand break, SSB），有效降低脱靶活性。4....
通过将RuvC（D10A）和NHN（H840A）两个核酸酶结构域分别进行氨基酸突，从而得到一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但仍保留结合DNA的能力，这样的Cas9 称之为dCas9（Dead Cas9）。目前CRISPR/dCas9系统常用于基因组转录调控，用以激活或抑制特定基因的表达，从而达到研究基因功能的目的。图1....
但由于dCas9-KRAB需要接触到靶标基因的调控序列,因此会因为不同基因所处染色体位置不同而产生不同的抑制程度,这取决于它们的内源染色质状态,另外dCas9 可能会抑制操纵子内的下游基因(极性效应)而不是单个基因。 转录激活(CRISPRa):通过使用dCas9融合蛋白来招募转录激活因子,从而达到靶标基因转录激活或上调的效果。...
最近一个令人振奋的研究进展是使用CRISPR/Cas9系统的dCas9版本来针对蛋白域进行转录调控[26,51,52]、表观遗传修饰[25]和特定基因组位点的显微可视化[27]。CRISPR/Cas9系统只需要重新设计crRNA即可改变靶标特异性。这与其他基因组编辑工具形成鲜明对比，包括ZFNs和TALENs，后者需要重新设计蛋白质- DNA界面。此外，CRISPR...
Cas9 D10A Nickase(0.1μg/μL) 500μL 10×Reaction Buffer 1mL保存:-20℃10mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.1mM EDTA,50% Glycerol,PH7.4@25℃。 基于蛋白与sgRNA转染的非病毒载体CRISPR基因敲除; 基于蛋白与sgRNA转染的非病毒载体CRISPR基因敲入; sgRNA剪切靶点DNA效率检测,降低体内筛选成本; 体外剪切靶DNA的特异...
转录激活(CRISPRa):通过使用dCas9融合蛋白来招募转录激活因子,从而达到靶标基因转录激活或上调的效果。在哺乳动物细胞中,VP64(一种转录激活子,由四个串联拷贝的单纯疱疹病毒VP16激活结构域组成,通过Gly-Ser连接子连接。)、p65激活结构域 (NF-κB转录因子核形式多肽的主要反式激活结构,p65AD) 或Rta47(人类疱疹病毒...
293T ゛s9Nick 细胞是用HEK293T 细胞构建的稳定表达Cas9蛋白的细胞株。在转入gRNA 表达质粒或者化学合成的gRNA 后可以对细胞基因组DNA 进行定点切割。也可以配合验证载体pTYNE 载体实现对基因敲除靶点的筛选和验证。 细胞系构建方法简介：1、 Cas9Nicknase 蛋白慢病毒表达载体pLV ゛s9Nick ﹗ro 包装为慢病毒。2、 ...
转录激活(CRISPRa):通过使用dCas9融合蛋白来招募转录激活因子,从而达到靶标基因转录激活或上调的效果。在哺乳动物细胞中,VP64(一种转录激活子,由四个串联拷贝的单纯疱疹病毒VP16激活结构域组成,通过Gly-Ser连接子连接。)、p65激活结构域 (NF-κB转录因子核形式多肽的主要反式激活结构,p65AD) 或Rta47(人类疱疹病毒...
dCAS9是 “dead ”CAS或 “dead CAS9 ”的缩写，是一种无DNA切割能力CAS9的蛋白质。原生 CAS9 蛋白是一种核酸酶，具有切割双链或单链 DNA 的能力。当它与 CRISPR 和 gRNA 结合时，就会在指定位置特异性地切割 DNA。dCAS9的催化结构域的D10A 或 H840A 发生突变，不能执行切割DNA的功能。因此，将 CAS9 ...