a.配制tbst:tris-hcl20mm,ph7.4(25℃),nacl150mm,tween-200.01%。 b.配制封闭液:5%脱脂牛奶(1g脱脂奶粉+20mltbst) c.取出已转好的膜与tbst中洗5min,用封闭液将膜覆盖,室温、摇床、封闭120min。 结合一抗: 封闭结束后,用tbst洗膜5min,根据目的蛋白的分子量剪膜,分别孵育目的抗体,各抗体来源为bax(abcam,a...
1.7 Western blotting 使用含 PMSF(Beyotime,中国)的 RIPA(Biosharp,中国)缓冲液提取细胞总蛋 白;用 10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白质裂解物,转膜;将 PVDF 膜用 5% 脱脂牛奶(Biosharp,中国)封闭 1 h,4 ℃条件下与羊抗兔抗 TBL1XR1 抗体(55312- 1-AP,Proteintech,中国),羊抗鼠抗 GAPDH 抗体 (60004-1-IG,...
按照如下叠放顺序:电源正极-滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸-电源负极,300ma湿转1h;pvdf膜置于5%脱脂奶粉中,封闭2h;tbst漂洗pvdf膜3min,加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗(1:1000),4℃孵育过夜;次日tbst漂洗5min*3,加入适量的二抗(1:2000),室温孵育2h;最后tbst漂洗10min*3,使用ecl试剂显色。 (1-4)实时定量pcr:通过...
待样品冷却后-20℃保存备用;制胶用的玻璃板清洗后烘干,用灭菌水进行检漏,滤纸吸干净,备用;配制浓度为10%的sds聚丙烯酰胺分离胶、浓度为5%的sds聚丙烯酰胺浓缩胶;将提取的蛋白上样后进行80v,35分钟;120v,80分钟的电泳;将预先配置好的转膜液放入4℃预冷,转膜采用三明治-湿转方法,电流290ma转膜1.5h后...