6) 在30 度孵育平板,每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5 天出现,不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。接下来做结果分析。 2. (电转化)方法:电转化毕赤酵母时用以下程序。转化子不需要铺在上层琼脂。从含HIS 转化子平板开始。 1) 吸取1-2ml 灭菌水于所有HIS 转化子平板上。 2) 用灭菌刮子重悬HIS 转化...
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种,都具有HIS4营养缺陷标记。其中,GS115茵株具有AOX1基因,是Mut+,即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入,表型为Muts,即甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。 Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外...
②、应用特定菌株：例如SuperMan5HIS-、SuperMan5和SuperMan5（pep4-, prb1-）等毕赤酵母菌株被用于生产目标蛋白，这些菌株能使目标蛋白在N-连接位点具有甘露糖-5结构，更接近哺乳动物细胞中的糖基化模式。SuperMan5菌株可用于表达疫苗抗原，通过引入异源活性酶并添加N-乙酰葡萄糖胺，进一步改造为能产生类人糖蛋白...
gs115his4基因突变了不能在组胺酸缺陷型培养基毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选上生长一般的ypd培养基营养丰富什么都有了而ynb却只含基本氮源gs115应该在上面不长就是从ypd上挑菌落在ynb和补充了his的平板上对应的点一下在his上长而ynb上不长的是gs115这样能挑到纯的以防突变毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的...
常用的毕赤酵母宿主菌基因型和表型如下图所示，其中GS115，KM71和SMD1168含有HIS4基因突变而不能合成组氨酸，部分表达载体中含有HIS4基因作为筛选标记，转化子可以在组氨酸缺陷型培养基中生长。另外GS115，X33，和SMD系列菌株含有野生型的A0X1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的，转化子通常产生Mut+甲醇利用...
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5m l YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；2. 取100-500µl（≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、...
1、质粒构建,实验室小量纯化可在构建时加入HIS标签,便于后续提高纯化效率 2、质粒转化,毕赤酵母质粒转化采用电转化的方式,酵母感受态市售较贵可自行制备,制备时先接种X33/GS115菌种于YPD平板活化,生长2-3天…
提取β-淀粉酶重组质粒DNA,用SalI酶进行酶切线性化处理,电转化P.pastorisGS115感受态细胞。取转化液涂布MD平板,30 ℃培养转化子。转化子长出后筛选His+表型和筛选高拷贝转化子。高拷贝转化子筛选的遗传霉素(G418)质量浓度梯度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL。
GS115毕赤酵母是是组氨酸缺陷型(His4基因型),如果表达载体上携带有组氨酸基因,可补偿宿主菌的组氨酸缺陷,因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。 GS115毕赤酵母可以在YPD培养基中生长,或者在补充有组氨酸的minimal media中生长,但是无法在单独的minimal media...