1,首先需要根据三个目标基因及Actin的序列设计四对引物,引物设计原则同普通PCR引物,网上有很多介绍的,最好其中一个引物是结构基因部分序列+内含子部分序列这种模式。序列长一些25++,退火温度高一些(一般检测时常会60℃附近做两步法扩增),尽量选择错配情况少的引物组合。许多软件,如primer primer 5可以协助做引物设计。
在做PCR之前构建，因为PCR就是体外DNA扩增，你放进去什么DNA，它就扩增什么DNA。你用限制酶切下载体（质粒）和目的基因片段，再用DNA连接酶，组成重组质粒，这样构建就可以了，放进PCR仪中，它自动扩增 这个酶要求是耐高温酶，建议添加Taq酶
提高反转录时加的RNA量，提高qPCR体系中cDNA的量，增大qPCR反应体系
可是2-△△Ct方法前提是对照组目的基因肯定表达, 137167741 随便选择一个表达的基因,你所谓的对照以及诱导都相对于这个基因就行了,这样对照为0,诱导组不为0,结果的表现形式有多种,相对荧光定量,相对者可以根据自己的实验要求,适当选择,这种情况,很多文章里面都有的,多看看文章. dirkyoung 这种情况还做QRT干嘛啊,...
你仅仅只是要算这个基因的表达量。那选一种办法决出一条序列作为代表可能就足够了。有些二代分析工具...
DNA聚合酶要选择具有3'到5'外切酶活性的酶，这样在PCR扩增过程中，从引物方向过来的DNA聚合酶会把寡核苷酸一个个切掉，在切掉之后，淬灭基团被破坏，荧光信号散发出来被仪器接收，每复制一条DNA就产生一个荧光信号，荧光信号累积就能与PCR产物同步，这样就是跟踪PCR产物。楼主提取质粒以后需要经过一次琼脂糖...
荧光定量PCR引物设计 本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得
就是连上个载体吧 [ 发自小木虫客户端 ]
RT-PCR同一次的扩增为何有些管中没有产物给位rt-PCR的高手们,做RT-PCR我有八个样品,做完RT后,在做cDNA扩增后发现只有3个样品中有目的条带--,其余的5个都没有条带,而且我做的是管家基因b-actin的
你选了个什么内参，表达量如此之低？感觉有点问题，检查一下融解曲线对不对。如果是正确的，说明你的目的基因表达量比内参高出一千倍啊。Ct值越大，表达量越低。