通过梯度退火使引物探针与目标 mRNA 结合，使用链霉亲和素C1磁珠提取目标物，随后利用RNase H在特定的位置进行切割从而将帽子从 mRNA 上酶切下来，最后更换溶剂条件解开引物与 mRNA 5’ 端的结合并回收核苷酸片段，通过LC-MS进行 mRNA 加帽率分析。二、mRNA加帽率检测方法 方法一 该分析方法中所用的 RNase H 酶...
当前加帽率的检测思路为：通过酶切获得5’端RNA片段（长度约几十个核苷酸），随后通过聚丙烯酰胺凝胶、液相色谱（HPLC）或液质联用（LC-MS）等方法分离不同长度的5’端寡核苷酸片段，从而定量评估mRNA的加帽率。使用RNase H将长链RNA分子切割成短片段（<50个碱基），然后在聚丙烯酰胺凝胶上实现分离（图2e）。聚丙烯...
mRNA的帽结构可维持体内稳定性,促进蛋白的翻译。加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标,带帽结构的mRNA占比可影响mRNA的免疫原性和翻译效率。 本期文章菌菌将分享基于RNase H的mRNA加帽率检测方法,涵盖探针设计、酶切处理(前处理)、基于LC-MS的寡核苷酸分析。菌菌主要参考了CDE、WHO指导原则,以及美国药典USP推荐的...
为了方便加帽率检测探针设计,降低序列转换错误率,减少酶切产物等分子量计算工作量,近岸蛋白特别推出“mRNA加帽率检测工具箱”,包括探针设计、反应体系计算、酶切产物分子量计算等模块,网址https://www.novoprotein.com.cn/tool-class。注册近岸蛋...
1.基于RNase H的mRNA加帽率 分析技术流程 质谱是目前检测加帽率最有效的途径，且质谱平台在生物制药领域具有一定的通用性。明捷医药已建立mRNA加帽率检测的完整能力，包括起始的探针设计、样品前处理、LC-MS检测、数据分析和方法验证等，检测流程见图2。图2.RNase H酶介导的加帽率检测流程 2.案例分析 Case 1优化...
mRNA的帽结构可维持体内稳定性,促进蛋白的翻译。加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标,带帽结构的mRNA占比可影响mRNA的免疫原性和翻译效率。 本期文章菌菌将分享基于RNase H的mRNA加帽率检测方法,涵盖探针设计、酶切处理(前处理)、基于LC-MS的寡核苷酸分析。菌菌主要参考了CDE、WHO指导原则,以及美国药典USP推荐的...
我们制备了编码荧光素酶的mRNA(luciferase mRNA)并对其进行了加帽率检测,对LC-MS目标峰的解卷积分析显示,mRNA加帽率大于90%。 2.5 纳米孔测序法 纳米孔测序是一种平台技术,可以对修饰/未修饰的mRNA进行直接测序。单个RNA分子被驱动到嵌入合成膜中的纳米级蛋白质通道孔中。RNA的序列通过测量分子穿过孔隙时电流的变化...
该方法是当前工艺中常用的加帽率检测方法。2022年，BioNTech公司Vlatkovic I等在Pharmaceutics发表文章《Ribozyme Assays to Quantify the Capping Efficiency of In Vitro-Transcribed mRNA》。该研究提出，由于RNase H切割位点的专一性不稳定，可能产生其他切割产物，影响结果的可靠性。为改善这一不足，Vlatkovic I等设计...
长链编码RNA通常由成千上万个核苷酸(nt)组成,而加帽与未加帽的mRNA仅相差一个甲基化鸟苷(m7G),这一微小的差异导致其在全长mRNA中难以区分。当前加帽率的检测思路为:通过酶切获得5’端RNA片段(长度约几十个核苷酸),随后通过聚丙烯酰胺凝胶、液相色谱(HPLC)或液质联用(LC-MS)等方法分离不同长度的5’端寡核苷...
加帽与未加帽的mRNA仅相差一个核苷酸(m7G),相对于完整的mRNA太小,难以区分。当前加帽率的检测思路为:采用酶切方式获得5’端加帽或不加帽的寡核苷酸序列,随后通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效液相色谱(HPLC)或液相质谱联用(LC-MS)等方法分离不同大小的寡核苷酸片段,从而定量评估mRNA的加帽率。